6 Novembre 2021 Pubblicato da Marco Tosatti

Marco Tosatti

Cari amici e nemici di Stilum Curiae, mi sembra utile e interessante portare alla vostra attenzione questo studio, pubblicato su MDPI, https://www.mdpi.com/1999-4915/13/10/2056/htm  una catena di pubblicazioni scientifiche, sui danni che la proteika Spike, quella utilizzata nei vaccini mRNA, provoca a medio e lungo termine negli organismi, indebolendo le capacità di difesa naturali e impedendole. L’articolo originale, peer reviewed e accettato per la pubblicazione, è stato preparato da studiosi delle università svedesi di Umea  e di Stoccolma. Buona lettura.

§§§

Abstract

La sindrome respiratoria acuta grave da coronavirus 2 (SARS-CoV-2) ha portato alla pandemia della malattia da coronavirus 2019 (COVID-19), colpendo gravemente la salute pubblica e l’economia globale. L’immunità adattativa gioca un ruolo cruciale nella lotta contro l’infezione da SARS-CoV-2 e influenza direttamente gli esiti clinici dei pazienti. Gli studi clinici hanno indicato che i pazienti con grave COVID-19 mostrano risposte immunitarie adattative deboli e ritardate; tuttavia, il meccanismo con cui la SARS-CoV-2 impedisce l’immunità adattativa rimane poco chiaro.

Qui, usando una linea cellulare in vitro, riportiamo che la proteina spike della SARS-CoV-2 inibisce significativamente la riparazione dei danni al DNA, che è necessaria per un’efficace ricombinazione V(D)J nell’immunità adattativa. Meccanicamente, abbiamo scoperto che la proteina spike si localizza nel nucleo e inibisce la riparazione dei danni al DNA impedendo il reclutamento delle proteine chiave per la riparazione del DNA BRCA1 e 53BP1 nel sito del danno. I nostri risultati rivelano un potenziale meccanismo molecolare attraverso il quale la proteina spike potrebbe impedire l’immunità adattativa e sottolineano i potenziali effetti collaterali dei vaccini basati su spike full-length.

Parole chiave: SARS-CoV-2; spike; riparazione dei danni al DNA; ricombinazione V(D)J; vaccino

1. Introduzione

Il coronavirus 2 della sindrome respiratoria acuta grave (SARS-CoV-2) è responsabile dell’attuale pandemia di coronavirus 2019 (COVID-19) che ha provocato più di 2,3 milioni di morti. La SARS-CoV-2 è un virus a RNA positivo singolo avvolto che consiste di proteine strutturali e non strutturali [1]. Dopo l’infezione, queste proteine virali dirottano e disregolano il macchinario cellulare dell’ospite per replicare, assemblare e diffondere i virus di progenie [2]. Recenti studi clinici hanno dimostrato che l’infezione da SARS-CoV-2 colpisce straordinariamente il numero e la funzione dei linfociti [3,4,5,6]. Rispetto ai sopravvissuti lievi e moderati, i pazienti con COVID-19 grave manifestano un numero significativamente inferiore di cellule T totali, cellule T helper e cellule T soppressorie [3,4]. Inoltre, la COVID-19 ritarda i livelli di IgG e IgM dopo la comparsa dei sintomi [5,6]. Collettivamente, queste osservazioni cliniche suggeriscono che la SARS-CoV-2 colpisce il sistema immunitario adattativo. Tuttavia, il meccanismo con cui la SARS-CoV-2 sopprime l’immunità adattativa rimane poco chiaro.

Come due sistemi critici di sorveglianza dell’ospite, il sistema immunitario e quello di riparazione del DNA sono i sistemi primari su cui gli organismi superiori fanno affidamento per la difesa contro diverse minacce e l’omeostasi dei tessuti. Prove emergenti indicano che questi due sistemi sono interdipendenti, specialmente durante lo sviluppo e la maturazione dei linfociti [7]. Come una delle principali vie di riparazione della rottura del doppio filamento del DNA (DSB), la riparazione non omologa (NHEJ) gioca un ruolo critico nella ricombinazione V(D)J mediata da endonucleasi geniche (RAG) specifica dei linfociti, che risulta in un repertorio altamente diversificato di anticorpi nelle cellule B e nei recettori delle cellule T (TCR) nelle cellule T [8]. Per esempio, la perdita di funzione di proteine chiave di riparazione del DNA come ATM, DNA-PKcs, 53BP1, ecc., porta a difetti nella riparazione NHEJ che inibiscono la produzione di cellule B e T funzionali, portando all’immunodeficienza [7,9,10,11]. Al contrario, l’infezione virale di solito induce danni al DNA attraverso diversi meccanismi, come l’induzione della produzione di specie reattive dell’ossigeno (ROS) e lo stress di replicazione della cellula ospite [12,13,14]. Se il danno al DNA non può essere adeguatamente riparato, contribuirà all’amplificazione della patologia indotta dall’infezione virale. Pertanto, abbiamo voluto indagare se le proteine della SARS-CoV-2 dirottano il sistema di riparazione dei danni al DNA, influenzando così l’immunità adattativa in vitro.

……

 Risultati

3.1. Effetto delle proteine virali SARS-CoV-2 localizzate nel nucleo sulla riparazione dei danni al DNA

La riparazione dei danni al DNA avviene principalmente nel nucleo per garantire la stabilità del genoma. Sebbene le proteine della SARS-CoV-2 siano sintetizzate nel citosol [1], alcune proteine virali sono rilevabili anche nel nucleo, comprese Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14 e Nsp16 [19]. Abbiamo studiato se queste proteine localizzate nel nucleo della SARS-CoV-2 influenzano il sistema di riparazione dei danni al DNA della cellula ospite. Per questo, abbiamo costruito questi plasmidi di espressione delle proteine virali insieme ai plasmidi di espressione di spike e nucleoproteine, che sono generalmente considerate proteine localizzate nel citosol. Abbiamo confermato la loro espressione e localizzazione tramite immunoblotting e immunofluorescenza. I nostri risultati sono stati coerenti con quelli di studi precedenti [19]; le proteine Nsp1, Nsp5, Nsp9, Nsp13, Nsp14 e Nsp16 sono effettivamente localizzate nel nucleo, e le nucleoproteine sono principalmente localizzate nel citosol. Sorprendentemente, abbiamo trovato l’abbondanza della proteina spike nel nucleo (Figura 1A). La riparazione NHEJ e la riparazione della ricombinazione omologa (HR) sono due importanti vie di riparazione del DNA che non solo controllano continuamente e garantiscono l’integrità del genoma, ma sono anche vitali per le funzioni delle cellule immunitarie adattative [9].

Per valutare se queste proteine virali ostacolano la via di riparazione DSB, abbiamo esaminato la riparazione di un DSB sito-specifico indotto dall’endonucleasi I-SceI usando la proteina a fluorescenza verde a ripetizione diretta (DR-GFP) e i sistemi reporter total-NHEJ-GFP (EJ5-GFP) per HR e NHEJ, rispettivamente [15,16]. La sovraespressione di Nsp1, Nsp5, Nsp13, Nsp14, e delle proteine spike ha diminuito l’efficienza di entrambe le riparazioni HR e NHEJ (Figura 1B-E e Figura S2A,B). Inoltre, abbiamo anche trovato che la sovraespressione di Nsp1, Nsp5, Nsp13, e Nsp14 ha drammaticamente soppresso la proliferazione rispetto alle altre proteine studiate. Pertanto, l’effetto inibitorio di Nsp1, Nsp5, Nsp13 e Nsp14 sulla riparazione dei danni al DNA può essere dovuto a effetti secondari, come l’arresto della crescita e la morte cellulare. È interessante notare che la proteina spike sovraespressa non ha influenzato la morfologia o la proliferazione cellulare, ma ha soppresso significativamente sia la riparazione HR che NHEJ.

…..

Poiché le proteine spike sono fondamentali per mediare l’ingresso del virus nelle cellule ospiti e sono al centro della maggior parte delle strategie vaccinali [20,21], abbiamo ulteriormente studiato il ruolo delle proteine spike nella riparazione dei danni al DNA e nella ricombinazione V(D)J associata. Di solito si pensa che le proteine spike siano sintetizzate nel reticolo endoplasmatico ruvido (ER) [1]. Dopo modifiche post-traslazionali come la glicosilazione, le proteine spike trafficano attraverso l’apparato di membrana cellulare insieme ad altre proteine virali per formare il virione maturo [1]. La proteina spike contiene due subunità principali, S1 e S2, così come diversi domini funzionali o ripetizioni [22] (Figura 2A). Allo stato nativo, le proteine spike esistono come proteine inattive a lunghezza intera. Durante l’infezione virale, le proteasi della cellula ospite, come la furina proteasi, attivano la proteina S scindendola nelle subunità S1 e S2, che è necessaria per l’ingresso virale nella cellula bersaglio [23]. Abbiamo ulteriormente esplorato diverse subunità della proteina spike per chiarire le caratteristiche funzionali richieste per l’inibizione della riparazione del DNA. Solo la proteina spike completa ha fortemente inibito sia NHEJ che la riparazione HR (Figura 2B-E e Figura S4A,B). Successivamente, abbiamo cercato di determinare se la proteina spike contribuisce direttamente all’instabilità genomica inibendo la riparazione DSB. Abbiamo monitorato i livelli di DSBs utilizzando saggi di cometa. A seguito di diversi trattamenti di danno al DNA, come γ-irradiazione, trattamento con doxorubicina e trattamento H2O2, c’è meno riparazione in presenza della proteina spike (Figura 2F,G). Insieme, questi dati dimostrano che la proteina spike influenza direttamente la riparazione del DNA nel nucleo.

§§§

Condividi i miei articoli:

Tag: covid, spike, svezia, vaccini

Categoria: covid